無菌環(huán)境如何監(jiān)控和檢測?
2023-08-23
微生物檢測人員天天都需要在無菌室工作，在超凈臺或者生物安全柜里操作，為了保證我們檢測的準(zhǔn)確性，我們必須要求無菌室以及工作臺符合要求，那我們應(yīng)該怎樣進(jìn)行驗(yàn)證呢？下面我們介紹一下環(huán)境中無菌或殺菌效果應(yīng)如何檢查。紫外燈在使用過程中輻射強(qiáng)度會逐漸降低，影響其殺菌效果，故應(yīng)該定期檢查。紫外燈的殺菌有效波長是253.7nm，其強(qiáng)度可以用中心波長254nm的紫外線強(qiáng)度計測定。在沒有紫外線強(qiáng)度計的情況下可以采用生物學(xué)替代。生物學(xué)測試簡要步驟如下：選用枯草芽孢桿菌ATCC 9372，制成106CFU/mL~108CFU/mL濃度的菌懸液；選用經(jīng)脫脂處理的0.5cm×1.0cm大小的布片或鋁片，高壓滅菌后用作載體；每個載體上滴一滴制備好的菌懸液，干燥后備用；將8個染菌載體放于無菌器皿中，置于紫外燈下1m~1.5m處，開啟紫外燈照射，于0.5h、1h、1.5h和2h各取出2個染菌載體，分別投入盛有5mL緩沖蛋白胨水的洗脫液；系列稀釋后進(jìn)行平板計數(shù)；同法取8個染菌載體用做陽性對照，操作除不經(jīng)紫外此昂照射外與試驗(yàn)組相同。殺滅率=（陽性對照回收菌數(shù)-試驗(yàn)組回收菌數(shù)）/陽性對照回收菌數(shù)×100%殺滅率大于99.9%時，認(rèn)為紫外燈殺菌效果合格。無菌室空氣質(zhì)量檢查應(yīng)按照采樣計劃，根據(jù)情況對處于空態(tài)、靜態(tài)和正常運(yùn)行的風(fēng)險區(qū)，使用適當(dāng)?shù)膬x器采集空氣中微生物，測定并監(jiān)控風(fēng)險區(qū)空氣的微生物污染?？諝鈶腋∥⑸锏牟蓸雍陀嫈?shù)方法多種多樣，根據(jù)不同采樣目的決定具體的采樣方法和采樣器。因采樣器的采集效率不同，應(yīng)慎重選擇合適的方法和設(shè)備。采樣器分為兩類：被動式采樣器，如落菌盤；主動式采樣器，如過濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。落菌盤等被動式空氣微生物采樣器不能測量空氣中的微生物的總數(shù)，而是測量空氣中微生物在表面的沉降率。只要確定單位時間落菌盤上微生物的數(shù)量，再根據(jù)落菌盤的暴露面積與暴露時間之間的關(guān)系，即可大致計算出空氣中微生物的數(shù)量。面積小于30m2的室內(nèi)設(shè)一條對角線取3點(diǎn)，在其中心以及兩端距墻1m處各取1點(diǎn)；面積大于30m2的室內(nèi)房間四面距墻1m和中央各放置一個平皿，高度為實(shí)驗(yàn)臺高度。培養(yǎng)基平皿開蓋暴露10min，然后蓋上蓋子倒放，培養(yǎng)48h，計數(shù)每個平皿上的菌落數(shù)。日常監(jiān)控時，可以設(shè)定可接受的菌落數(shù)限值。一般無菌室所有的取樣平皿上的細(xì)菌總數(shù)應(yīng)小于15個?？諝赓|(zhì)量良好的無菌室，通常每個平皿上生長的細(xì)菌不超過2個菌落數(shù)。空氣采樣除了自然沉降法外，還可以使用專門的主動式采樣器。主動式采樣器可以評估風(fēng)險區(qū)空氣微生物的特征。主動式采樣器主要包括過濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。撞擊采樣器可以分為狹縫式采樣器、離心式采樣器和針孔式采樣器。狹縫式采樣器由附加的真空抽氣泵抽氣，通過采樣器的縫隙式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉(zhuǎn)的平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)過培養(yǎng)后形成菌落，予以計數(shù)。離心式采樣器由于內(nèi)部風(fēng)機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心機(jī)的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時間撞擊到專用的固形培養(yǎng)條上，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落，予以計數(shù)。過濾式空氣采樣器是最常用、最簡單的空氣采樣器。過濾式采樣器有采樣頭、濾器、流量計和抽氣泵組成。過濾式采樣器的結(jié)構(gòu)如圖：開動電機(jī)后，抽氣泵工作，帶動空氣吸入采樣頭，空氣通過濾器的時候，大于濾膜孔徑的顆粒被阻留，當(dāng)達(dá)到預(yù)先設(shè)定吸氣體積后抽氣泵停止工作，將濾膜取出轉(zhuǎn)貼到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后計算空氣中微生物的濃度。過濾式采樣器捕獲效率高，但是濾膜材料可能影響微生物的存活率，還有采樣阻力大、流量易變的缺陷。在沒有空氣采樣器的情況下，可以自己組裝如下圖的空氣錯率采樣裝置，注意組裝連接處必須密不透風(fēng)。打開圖中大瓶的龍頭，空氣就被抽入無菌水中。待4L水流完，就有4L空氣通過小瓶中的無菌水，也就是4L空氣中的微生物被留存在50mL無菌水中。無菌吸取1mL過濾的水樣進(jìn)行平板計數(shù)，做2個平行。37℃培養(yǎng)48h計數(shù)。每升空氣中的細(xì)菌數(shù)為：2個平皿上細(xì)菌數(shù)量的平均值×50/4。表面微生物污染的檢查需要使用接觸器或拭子，獲得某表面某時間點(diǎn)的微生物數(shù)量。接觸器以容器內(nèi)已知面積的固態(tài)培養(yǎng)介質(zhì)與表面接觸，接觸面積應(yīng)大于20cm2，均勻用力將整個營養(yǎng)介質(zhì)壓住表面幾秒鐘，不得移動。然后將裝置放回容器內(nèi)，再清潔采樣表面，清除殘留營養(yǎng)物。接觸器培養(yǎng)后顯現(xiàn)的菌落可以給出原表面微生物的存活狀況的鏡像“圖”。使用拭子更為簡單和靈活，用拭子擦拭某個表面，它抹去的微生物數(shù)量就可以計算出了。對接觸裝置觸及不到的、不平或有凹陷的非吸收性大表面，用拭子采樣特別方便。棉拭子的操作方法如下：準(zhǔn)備材料：自制無菌棉拭子或購買商品化的無菌棉拭子、內(nèi)徑10cm×10cm無菌規(guī)格板、無菌生理鹽水、培養(yǎng)基平皿。如果取樣物體是平面的，將無菌規(guī)格板放在物體表面，用浸濕的無菌棉拭子在無菌規(guī)格板空心處橫豎涂抹均勻，涂抹時隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，剪去棉拭子與手接觸部分，將棉拭子放入裝有一定體積的無菌生理鹽水中待檢。將采樣管敲打80次以上是棉拭子上的細(xì)菌充分?jǐn)U散，做適當(dāng)稀釋，進(jìn)行平板計數(shù)，37℃培養(yǎng)48h計數(shù)。細(xì)菌總數(shù)（CFU/cm2）=（平皿上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/采樣面積（cm2）被檢人員洗手消毒后，五指并攏。將浸泡過的棉拭子沿雙手指屈從指根到指端往返涂擦兩次，涂擦的同時轉(zhuǎn)動棉拭子。剪去操作者手接觸部位，將棉拭子放入裝有一定體積的無菌室生理鹽水中待檢。按“無菌室物體表面細(xì)菌污染檢查”的方法進(jìn)行樣品處理、接種、培養(yǎng)、計數(shù)和報告結(jié)果。
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